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AP-SMALDI 3D質譜成像技術可視化呈現藥用植物馬利筋葉片中防御性代謝物空間分布及變化

        導言:基質輔助激光解吸電離質譜成像技術(MALDI-MSI)發展至今,受到國際及國內眾多專家學者的關注與認可。該技術既能夠可視化呈現目標化合物在組織和細胞中的二維離子密度圖,還能夠同時呈現眾多其它化合物的組成、相對豐度及空間分布情況,實現對生物樣本的無標記、高通量檢測。自動聚焦3D AP-SMALDI質譜成像技術的橫空出世為非平面生物樣本的檢測提供了更為高效和強有力的技術支撐,可直接用于植物葉片、花瓣等樣本表面化合物的可視化分析。自然界中,植物在整個生長周期內會受到來自方方面面的威脅,如生物脅迫和非生物脅迫,其中生物脅迫包括植食性動物以及各種病原微生物的侵害。為了面對植食性動物這個宿敵,植物的防御手段也可謂多種多樣,其中直接防御措施就是植物在被取食時產生有毒的次生代謝產物以此傷害來侵害的植食性動物,影響其生長發育。

        2021年2月5日,德國吉森大學Bernhard Spengler教授團隊在Analytical and Bioanalytical Chemistry上發表了名為 “3D-surface MALDI mass spectrometry imaging for visualising plant defensive cardiac glycosides in Asclepias curassavica ”的文章,研究人員利用3D表面MALDI-MSI技術,以馬利筋為研究對象,對馬利筋苷等8種強心苷類植物防御性物質進行了空間解析。結果表明,大量防御相關代謝物分布于機械損傷(模擬草食動物攻擊) 馬利筋葉片(葉片表面高度變化達700μm)的受損傷部位。本研究充分展示了自動聚焦AP-SMALDI質譜成像技術的強大能力和潛在的適用性,能夠分析近生理狀態下植物樣品的三維表面化合物分布信息。

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       在分析受損傷馬利筋葉片之前,作者利用3D AP-SMALDI質譜成像技術分析了完整葉片上強心苷類防御物質的空間分布。結果表明,在完整葉片中8種強心苷類防御性代謝物均分布在主脈內,即分布于無節乳汁管細胞所包含的高濃度乳汁中(圖1)。

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       圖1(a)3D AP-SMALDI MSI檢測后的馬利筋葉片光學顯微圖像。(b)葉片表面激光燒蝕斑放大圖像。(c)完整馬利筋葉片3D光學顯微圖像,葉片表面高度變化高達350μm(圖示藍色到紅色表示葉片表面高度越來越高。d RG疊加的MSI圖像,馬利筋苷(m/z613.2410,[M+K]+,紅色)二糖(m/z381.0793[M+H]+,綠色)。(e)從葉片葉脈區域獲得的質量范圍為m/z420-620的單像素質譜圖。MSI圖像178×178pixels,空間分辨率45μm,比例尺a、c、d為1mm、b為150μm。

       隨后作者檢測了機械損傷1小時后的馬利筋葉片,結果顯示,強心苷類防御性代謝物均集中分布于受損部位(圖2)。由于在葉片受損10min后其傷口處即可檢測到高濃度強心苷(圖3a-c),故用強心苷合成增多來解釋這一現象貌似并不合理。因此,本研究與以往研究一致認為乳汁是一種可分配的防御物質,即葉片受損傷后乳汁在第一時間運輸至受傷部位,使得有毒防御化合物在損傷部位迅速富集。

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       圖2(a)3D AP-SMALDI MSI檢測后的馬利筋葉片光學顯微圖像。(b)馬利筋葉片3D光學顯微圖像,損傷部位的高度差最高可達400μm。(c)RGB疊加MSI圖像,烏拉卡定(m/z569.2132,[M+K]+,紅色)、二糖(m/z365.1056,[M+Na]+,綠色)三羥基黃酮丙二酰糖苷(m/z557.0692,[M+K]+,藍色)。(d) 烏拉卡定(m/z569.2132,[M+K]+)。(e)二糖(m/z365.1056,[M+Na]+)。(f)三羥基黃酮丙二酰糖苷單離子圖像(m/z557.0692,[M+K]+)。MSI圖像143×171 pixels,空間分辨率35μm,所有比例尺均為1mm。

       進一步作者考察了防御代謝物不同時間點的積累速率,作者分別檢測了傷口間隔時間為4h50min(即葉片受損傷5h和10min后進行檢測)和22h(即葉片受損傷24h和2h后進行檢測)的機械損傷葉片。結果顯示,間隔時間較短的兩個傷口處強心苷類物質的積累量相差不大,而間隔時間較長的兩個傷口處則呈現出明顯的差異。葉片受損24小時后,受損部位強心苷類物質明顯減少,表明該類物質隨著時間的延長發生了轉移或降解(圖3)。

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       圖3(a,d)AP-SMALDI MSI檢測后葉片3D光學顯微圖像,對受傷區域進行標記,并標出相關的時間間隔。(b,e)3D顯微圖像,葉片表面高度差分別達500μm和600μm。(c,f)RGB疊加MSI圖像calotoxin(m/z587.2250,[M+K]+,紅色)二羥基黃酮(m/z255.0652,[M+H]+,綠色)m/z255.2110(藍色) MSI圖像c111×111 pixels,空間分辨率45μm,f112×103 pixels,空間分辨率35μm,比例尺為1mm。

       植物有防御手段,動物亦有捕食策略。許多植食性昆蟲通過脈切的方式來阻止植物防御。例如,捕食時昆蟲先切斷葉脈上端,使防御物質不能再轉移并積累在下游部位。因此,作者采用3D AP-SMALDI MSI技術對脈切葉片的近心端(切口上游)及遠心端(切口下游)傷口進行檢測,發現遠心端比近心端防御性代謝物積累明顯減少,說明脈切影響像Uscharin這類的防御性物質的轉移使其不能到達下游葉片發揮其防御作用,揭示了為什么大多數含有乳汁的植物(如馬利筋)的專門捕食者在取食葉片時采用脈切作為一種預防中毒的策略。

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       圖4(a)AP-SMALDI MSI檢測前葉片表面的光學顯微圖像,葉片表面滲出乳汁的區域被紅線標記出來。(b)葉片3D光學顯微圖像,高度差高達700μm。(c, d)RGB疊加MSI圖像Uscharin(m/z626.2189,[M+K]+,紅色),(d)脫鎂葉綠素a(m/z909.5291,[M+K]+,紅色)。m/z771.4869(藍色)丙二酰染料木甙(m/z557.0692,[M+K]+,綠色)是目標化合物c、d的背景信號。MSI圖像157×171pixels,空間分辨率40μm,比例尺為1mm。

       結論:本文采用自動聚焦3D AP-SMALDI MSI技術對馬利筋葉片中防御性代謝物進行了精確定位,表明乳汁是植物抵御組織損傷和潛在植食性昆蟲攻擊的化學防御機制的一部分,植物葉片受損后,乳汁流向傷口的速度增加,使得防御物質在葉片受損部位積累, 并進一步分析了這種積累速率在時間和空間上的變化。此外,研究人員模仿昆蟲的捕食策略(脈切)來抵御這種防御機制,觀察到在切割傷口的遠端有較少的有毒代謝物積累。同時,大量未識別的離子信號顯示出與強心苷類物質具有相同的空間分布,表明馬利筋中存在著多種多樣的防御性物質。因此,在MALDI 質譜成像的背景下,以HPLC-MS作為補充方法的非靶向代謝組學是發現和研究植物與草食性昆蟲和病原菌相互作用關系的絕佳方法,與此同時,組織原位MALDI MS/MS檢測同樣有助于對未知代謝物的鑒定。

 

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